利用 TiN 量子激元生物传感器检测单个C反应蛋白抗原分子

C反应蛋白(CRP)[1]是机体组织炎症的典型指标。 它由肝脏产生，其浓度随着巨噬细胞、白细胞和 T 细胞分泌 IL6 而增加。 CRP 的作用是与死亡或垂死细胞表面表达的溶血磷脂酰胆碱 (LPC) [2] 结合。 由于 LPC 充当“找到我”信号，并且死亡细胞释放 LPC 来招募吞噬细胞。 我们的身体免疫系统指示巨噬细胞白细胞吞噬死亡细胞。 CRP分子量约为115KDa。 为了测试我们的 QPLoC 系统的分析性能，CRP 抗体被功能化到我们的 TiN 等离子体生物芯片上。 而CRP抗原则反复稀释至已知浓度进行检测。 最终检测限为 3.26 aM（阿摩尔，即每升 3.26E-18 摩尔或每毫升约 2,000 个拷贝）。 由于我们的液体样品体积为0.36毫升，总共约720个CRP抗原分子或每个微孔中5个CRP分子。 这是对现有 SPR 系统的重大改进，现有 SPR 系统通常达到皮摩尔，即每升 1E-12 摩尔。 我们的 QPLoC 系统的性能比现有系统高出六个数量级，并且阿托摩尔灵敏度是可重复的。 我们的 QPLoC 传感协议保持无标记，样品制备相当简单。实验试剂 CRP抗原初始浓度为3.75mg/mL，而CRP抗体初始浓度为6.23mg/mL。

实验步骤如下：

1. 在 EP 管中用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 将 CRP 抗体溶液稀释至 0.623 ug/ml。
2. 从每个抗体EP管中取出100ul抗体稀释液加入TiN生物芯片中，用移液器在芯片表面滑动，使抗体均匀铺展在芯片表面。 室温孵育 30 分钟。
3. 抖落芯片表面的抗体试剂，用配制好的PB缓冲液冲洗3-5次，最后旋干。
4. 添加 1% 牛血清白蛋白 (BSA) 作为封闭剂，封闭 TiN 生物芯片，步骤与上述 2 和 3 相同。
5. 甩掉BSA溶液，用PBS缓冲液冲洗3-5次，室温干燥5分钟。
6. 立即使用或用铝箔袋存放在冰箱中，温度为 2-8°C。
7. CRP抗原溶液按系列反复稀释，即1/1E03→1/1E04→1/1E05→1/1E06→1/1E07→1/1E08→1/1E09→1/1E10→1/1E11→1/1E12→1 /1E13 → 1/1E14。 使用 1/1E13 稀释时，摩尔浓度为每毫升 3.26 个阿托摩尔或 1963 个 CRP 抗原分子。
8. 启动 QPLoC 系统并启动数据采集软件。 开机后，将CRP抗体功能化芯片安装到仪器夹具中，将纯化水放置在仪器的样品位上，并启动排气程序，用纯化水清洗生物芯片两次。
9. 将稀释后的抗原溶液从最低浓度开始放置在仪器的样品位置上，确保进样管位于样品液面下方，然后启动数据采集程序自动进行实验。
10. 系统记录前100帧以建立基线，然后捕获600帧用于CRP抗体-抗原结合，最后用纯化水冲洗后再拍摄100帧以确认结合成功。 每个 CRP 抗原浓度总共记录 800 帧。
11. 该系统以每秒 1 帧的速率捕获 CRP 抗原抗体结合的 TiN 生物芯片的相位图像。 图像尺寸为2,200像素见方，总共484万像素。 每个微孔大约占据 8,000 个像素。 每个像素的物理尺寸大约覆盖 5 微米见方。
12. 每个微孔的相图由远程服务器处理，每个像素的历史图也由我们的分析软件提取。

实验结果：

以下结果显示了我们的 QPLoC 生物传感器的阿托摩尔灵敏度。 图1是CRP抗体-抗原结合后特定微孔的相变的二维图。 图2是同一微孔用纯化水冲洗后的二维图作为参考。 图 3 显示了 2D 地图中特定像素的历史图，其中蓝色圆圈代表原始数据，红色曲线是原始数据集的 B 样条拟合图。 图4是3.26 aM CRP抗原浓度重复实验后同一微孔的2D相图的正态分布。 图 4 的数据集拟合 fit 1、拟合 fit 2 和拟合 fit 4 显示了相似的趋势，拟合 fit 3 以纯化水为参考。 仅结合几个 CRP 抗原分子，就可以在图 4 中观察到分布均值和方差的显着变化。 因此，我们声称我们的 QPLoC 生物传感器能够在微孔中检测单个 CRP 分子。

图 1. 3.26 aM CRP 抗原的二维相图

图 2. 纯化水的二维相图

图 3. 800 帧的像素历史图（包含原始数据和 B 样条曲线）

图 4. 重复 CRP 实验和参考的 2D 相位图的正态分布拟合

参考文献

[1] C-reactive protein, https://en.wikipedia.org/wiki/C-reactive_protein

[2] Lysophosphatidylcholine, https://en.wikipedia.org/wiki/Lysophosphatidylcholine